भाइरस न्यूक्लिक एसिड पत्ता लगाउने

अधिकांश भाइरसहरूको जीनोमिक अनुक्रमहरू ज्ञात छन्।न्यूक्लिक एसिड प्रोबहरू जुन पूरक भाइरल DNA वा RNA खण्डहरूसँग हाइब्रिडाइज गर्न डिजाइन गरिएको DNA को छोटो खण्डहरू हुन्।पोलिमरेज चेन रियाक्सन (PCR) भाइरल पत्ता लगाउनको लागि अझ प्रभावकारी प्रविधि हो।उच्च थ्रुपुट डायग्नोस्टिक विधिहरू हालै विकसित भएका छन्।

A. न्यूक्लिक एसिड हाइब्रिडाइजेशन प्रविधि

न्यूक्लिक एसिड हाइब्रिडाइजेशन, मुख्यतया दक्षिणी ब्लटिंग (दक्षिणी) र उत्तरी ब्लटिंग (उत्तरी) सहित, भाइरस निदान क्षेत्रमा द्रुत रूपमा विकास भइरहेको नयाँ प्रविधि हो।हाइब्रिडाइजेशन परखको औचित्य पूरक भाइरल DNA वा RNA खण्डहरूसँग हाइब्रिडाइज गर्न डिजाइन गरिएको DNA ("प्रोब" भनिन्छ) को छोटो खण्डहरू प्रयोग गर्नु हो।तताउने वा क्षारीय उपचारद्वारा, डबल-स्ट्र्यान्ड लक्षित DNA वा RNA एकल स्ट्र्यान्डमा विभाजित हुन्छन् र त्यसपछि ठोस समर्थनमा स्थिर हुन्छन्।त्यस पछि, प्रोब थपिन्छ र लक्षित DNA वा RNA संग हाइब्रिडाइज हुन्छ।प्रोबलाई आइसोटोप वा गैर-रेडियोएक्टिभ न्यूक्लाइडले लेबल गरिएको हुनाले, लक्षित डीएनए वा आरएनए अटोरेडियोग्राफी वा बायोटिन-एभिडिन प्रणालीद्वारा पत्ता लगाउन सकिन्छ।धेरै जसो भाइरल जीनोमहरू क्लोन र क्रमबद्ध गरिएको हुनाले, तिनीहरू नमूनामा जाँचको रूपमा भाइरस-विशिष्ट अनुक्रमहरू प्रयोग गरेर पत्ता लगाउन सकिन्छ।हाल, हाइब्रिडाइजेशन विधिहरूले समावेश गर्दछ: डट ब्लट, कोशिकाहरूमा सिटु हाइब्रिडाइजेसन, डीएनए ब्लटिङ (डीएनए) (सदर्न ब्लट) र आरएनए ब्लटिङ (आरएनए) (उत्तरी ब्लट)।

B.PCR प्रविधि

हालका वर्षहरूमा, PCR मा आधारित इन भिट्रो न्यूक्लिक एसिड एम्प्लीफिकेशन प्रविधिहरूको एक श्रृंखला विकसित गरिएको छ, संवेदनहीन वा खेती गर्न नसकिने भाइरसहरू परीक्षण गर्न।PCR एक विधि हो जसले विशेष DNA अनुक्रम इन भिट्रो पोलिमरेज प्रतिक्रिया द्वारा संश्लेषण गर्न सक्छ।PCR को प्रक्रियाले तीन चरणहरूको थर्मल चक्र समावेश गर्दछ: विकृतीकरण, annealing, र विस्तार उच्च तापक्रममा (93℃~95℃), डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA दुई एकल DNA स्ट्र्यान्डमा विभाजित हुन्छ;त्यसपछि कम तापक्रममा (37 ℃ ~ 60 ℃), दुई संश्लेषित न्यूक्लियोटाइड प्राइमरहरू पूरक DNA खण्डहरूमा एनाल हुन्छन्;जबकि Taq इन्जाइम (72 ℃) को लागि उपयुक्त तापक्रममा, नयाँ DNA चेनहरूको संश्लेषण प्राइमर 3'end बाट पूरक DNA टेम्प्लेटको रूपमा र एकल न्यूक्लियोटाइडहरू सामग्रीको रूपमा प्रयोग गरेर सुरु हुन्छ।त्यसोभए प्रत्येक चक्र पछि, एक DNA चेनलाई दुई चेनहरूमा विस्तार गर्न सकिन्छ।यो प्रक्रिया दोहोर्याउँदा, एक चक्रमा संश्लेषित प्रत्येक DNA चेनलाई अर्को चक्रमा टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ, र प्रत्येक चक्रमा DNA चेनको संख्या दोब्बर हुन्छ, जसको अर्थ PCR को उत्पादन 2n लग गतिमा बढाइन्छ।25 देखि 30 चक्र पछि, PCR को उत्पादन इलेक्ट्रोफोरेसिस मार्फत पहिचान गरिन्छ, र विशिष्ट DNA उत्पादनहरू UV प्रकाश (254nm) अन्तर्गत अवलोकन गर्न सकिन्छ।यसको विशिष्टता, संवेदनशीलता र सुविधाको फाइदाको लागि, PCR धेरै भाइरल संक्रमणहरू जस्तै HCV, HIV, CMV, र HPV को क्लिनिकल निदानमा अपनाईएको छ।PCR धेरै संवेदनशील भएकोले, यसले fg स्तरमा भाइरस DNA पत्ता लगाउन सक्छ, गलत सकारात्मक हुनबाट जोगिनका लागि अपरेशन धेरै सावधानीपूर्वक गर्नुपर्दछ।थप रूपमा, न्यूक्लिक एसिड परीक्षणमा सकारात्मक नतिजाको मतलब नमूनामा प्रत्यक्ष संक्रामक भाइरस छ भन्ने होइन।

पीसीआर प्रविधिको व्यापक प्रयोगको साथ, विभिन्न परीक्षण उद्देश्यका लागि पीसीआर प्रविधिमा आधारित नयाँ प्रविधि र विधिहरू विकास गरिन्छ।उदाहरणका लागि, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआरले भाइरल लोड पत्ता लगाउन सक्छ;टिस्यु वा कोशिकाहरूमा भाइरस संक्रमण पहिचान गर्नको लागि पीसीआर प्रयोग गरिन्छ;नेस्टेड PCR ले PCR को विशिष्टता बढाउन सक्छ।ती मध्ये, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर अझ छिटो विकसित भएको छ।धेरै नयाँ प्रविधिहरू, जस्तै TaqMan हाइड्रोलाइसिस प्रोब, हाइब्रिडाइजेशन प्रोब, र आणविक बीकन प्रोबलाई वास्तविक समय मात्रात्मक PCR प्रविधिमा जोडिएको छ, जुन क्लिनिकल अनुसन्धानमा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ।बिरामीको शरीरको तरल पदार्थमा भाइरल लोडलाई सही रूपमा पहिचान गर्नुको साथै, यो विधि औषधि-सहिष्णु उत्परिवर्ती पत्ता लगाउन पनि प्रयोग गर्न सकिन्छ।तसर्थ, वास्तविक समय मात्रात्मक PCR मुख्यतया उपचारात्मक प्रभाव मूल्याङ्कन र औषधि सहिष्णुता निगरानी मा लागू गरिन्छ।

C. भाइरल न्यूक्लिक एसिडको उच्च-थ्रुपुट पत्ता लगाउने

नयाँ आकस्मिक संक्रामक रोगहरूको द्रुत निदानको आवश्यकताहरू पूरा गर्न, विभिन्न उच्च-थ्रुपुट पत्ता लगाउने विधिहरू, जस्तै DNA चिप्स (DNA), स्थापना गरिएको छ।DNA चिपहरूका लागि, विशिष्ट प्रोबहरू संश्लेषित हुन्छन् र धेरै उच्च घनत्वमा सानो सिलिकन चिपहरूसँग जोडिएका हुन्छन् DNA प्रोब माइक्रोएरे (DNA) बनाउनका लागि जसलाई नमूनासँग हाइब्रिडाइज गर्न सकिन्छ।हाइब्रिडाइजेसनको संकेत कन्फोकल माइक्रोस्कोप वा लेजर स्क्यानरद्वारा चित्रित गर्न सकिन्छ र कम्प्युटरद्वारा थप प्रशोधन गर्न सकिन्छ र विभिन्न जीनहरू सम्बन्धी विशाल डाटा सेट प्राप्त गर्न सकिन्छ।DNA चिप दुई प्रकारका हुन्छन्।"संश्लेषण चिप" निम्नानुसार छ: विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लियोटाइडहरू सिधा चिप्समा संश्लेषित हुन्छन्।अर्को DNA पूल चिप हो।क्लोन गरिएको जीन वा PCR उत्पादनहरू स्लाइडमा व्यवस्थित रूपमा छापिएका छन्।DNA चिप टेक्नोलोजीको फाइदा भनेको ठूलो मात्रामा DNA अनुक्रमहरूको एकै साथ पत्ता लगाउनु हो।रोगजनक पत्ता लगाउने चिपको नवीनतम संस्करणले एकैपटक १७०० भन्दा बढी मानव भाइरसहरू पहिचान गर्न सक्छ।डीएनए चिप टेक्नोलोजीले परम्परागत न्यूक्लिक एसिड हाइब्रिडाइजेशन विधिहरूको समस्या समाधान गर्‍यो र भाइरल निदान र महामारी विज्ञान अध्ययनमा धेरै व्यापक अनुप्रयोगहरू छन्।